1、样品RNA的抽提

①取冻存已裂解的细胞，室温存放5分钟使其彻底融解。
②两相分离水相顶层的容积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%以及融解于当中的RNA。
③RNA沉定这时离心前不可见的RNA沉定将在管底端和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗移去上清液，清洗RNA沉定。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干躁小心吸去绝大多数乙醇溶液，使RNA沉定在室温空气中干躁5-10分钟。
⑥融解RNA沉定融解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其彻底融解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

2、RNA质量检测

1）紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯净度。
①浓度值测定
A260下读值为1表示40µgRNA/ml。样品RNA浓度值(µg/ml)计算公式为：A260×稀释倍数×40µg/ml。具体计算如下：RNA溶于40µlDEPC水中，取5ul，1:100稀释至495µl的TE中，测得A260=0.21RNA浓度值=0.21×100×40µg/ml=840µg/ml或0.84µg/µl。取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35µl，剩余RNA总量为：35µl×0.84µg/µl=29.4µg
②纯净度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯净度，比值范围1.8到2.1。
2）变性琼脂糖凝胶电泳测定
①制胶
②准备RNA样品
取3µgRNA，加3倍容积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度值为10µg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
③电泳
上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5–6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。
④紫外透射光下观察并拍照
RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。

3、样品cDNA合成

①反应体系
②混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。
③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。

4、梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR

①β-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度值为10的11次方，反应前取3μl按10倍稀释（加水27μl并充分混匀）为10的10次方，依次稀释至10的9次方、10的8次方、10的7次方、10的6次方、10的5次方、10的4次方，以备用。
②反应体系如下：
标准品反应体系
序号反应物剂量
1SYBRGreen1染料10μl
2阳性模板上游引物F0.5μl
3阳性模板下游引物R0.5μl
4dNTP0.5μl
5Taq酶1μl
6阳性模板DNA5μl
7ddH2O32.5μl
8总容积50μl
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
管家基因反应体系：
序号反应物剂量
1SYBRGreen1染料10μl
2内参照上游引物F0.5μl
3内参照下游引物R0.5μl
4dNTP0.5μl
5Taq酶1μl
6待测样品cDNA5μl
7ddH2O32.5μl
8总容积50μl
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃2分钟，然后93℃1分钟，55℃2分钟，共40个循环。

5、制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板

①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。
反应体系：
序号反应物剂量
110×PCR缓冲液2.5ul
2MgCl2溶液1.5ul
3上游引物F0.5ul
4下游引物R0.5ul
5dNTP混合液3ul
6Taq聚合酶1ul
7cDNA1ul
8加水至总容积为25ul
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）；72ºC延伸5分钟。
②PCR生成物与DNALadder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR生成物是否为单一特异性扩增条带。
③将PCR生成物进行10倍梯度稀释:将PCR生成物进行10倍梯度稀释:设定PCR生成物浓度值为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。

6、待测样品的待测基因实时定量PCR

①所有cDNA样品分別配置实时定量PCR反应体系。
体系配置如下：
序号反应物剂量
1SYBRGreen1染料10ul
2上游引物1ul
3下游引物1ul
4dNTP1ul
5Taq聚合酶2ul
6待测样品cDNA5ul
7ddH2O30ul
8总容积50ul
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②将配制好的PCR反应溶液置于RealtimePCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃2分钟预变性，然后按93℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。

7、实时定量PCR使用引物列表

引物设计软件：PrimerPremier5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。

8、电泳

各样品的目的基因和管家基因分別进行RealtimePCR反应。PCR生成物与DNALadder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView™染色，检测PCR生成物是否为单一特异性扩增条带。