生物制药纯化工艺开发了纯化工艺方案以纯化治疗用单克隆抗体。
经典的抗体纯化方法是使用Protein A亲和层析大量捕获细胞上清中的抗体之后，再使用其他层析方法去除抗体中的杂质。现在，我们给大家提出另一种方案，这种方案不使用亲和层析这一经典步骤，它使用了两根可互换的色谱步骤和非亲和性层析方法。这种纯化方案包括阳离子交换柱（CEX）和疏水电荷诱导（HCI）柱，并且无需进行过程中的过滤步骤。由于HCl层析介质具有去除各种不确定杂质的能力，因此该方案的病毒清除效率很高。该方案的规模可以比经典方法扩大1000到10000倍，并且保持各种抗体的平均总回收率＞70％。此纯化工艺过程中污染物的去除和产品质量与经典的亲和三步层析方法的相关杂质、产品质量相当。
蛋白质大规模纯化的经济性很重要，特别是对于治疗用抗体，治疗用抗体的使用量相对于其他生物制品来说是比较大的，一般都在100mg左右的级别。抗体占市场上治疗性生物制剂的很大比例，约占
重组蛋白产品销售总额的30％。基于抗体疗法相关的纯化成本往往特别高，因为纯化是开发，生产需要许多昂贵的层析介质。通常，抗体每剂需要较高的剂量，纯化方案对最终产品质量和工艺经济性都非常重要，因为仅纯化就可占下游加工成本的三分之二。当产品是单克隆抗体时，亲和捕获层析柱（如蛋白质A）的介质成本可能会超过其他原材料的成本。
尽管开发了在高流速情况下，层析介质的载量也有所提高的改进性能的高级层析介质，亲和层析法通常仍被用作捕获步骤，以满足纯度、产率和载量的要求。传统上，基于亲和层析的捕获步骤（蛋白质A或G）之后是至少一个或两个其他层析步骤。另外，需要一个或多个过程中的过滤步骤，将制品进行各种处理（调酸碱、过滤、超滤等）才能进行下一步的层析步骤。蛋白质A层析不仅比非亲和介质贵至少四到五倍，而且还可能存在蛋白A配体的脱落等问题。通常，即使使用亲和层析法，除非穿插了一个或多个精纯步骤，通常也无法获得足够纯度和好的病毒清除率。
通过消除下游加工中的特定步骤，可以在保持分子完整性和纯度的同时最大化生产率。我们描述了一种灵活，可互换，非亲和的两步纯化方法，由于其简单性和涉及的纯化步骤数少，与基于亲和层析的方案相比，该方法可以以较低的成本实现，总体回收率高，最终产品质量等同于传统三步层析的方法。
我们不仅减少了纯化过程的步骤数量，而且消除了对过程中浓缩或过滤的需求（这意味着更多的开发、优化、放大、清洁和清洁验证以及增加的过程）成本，同时也避免了在纯化过程中潜在的损失和产品质量变化的风险。减少纯化步骤数量将减少过程组件、缓冲液、储液罐和其他设备的数量。最后，两步纯化过程可以很容易地用于许多抗体分子的临床生产中，而对开发成本，时间和资源需求的投入却相对比较少。
两步纯化过程
两步纯化过程研究了两种不同的层析介质，阳离子交换（CEX）介质和疏水电荷诱导（HCI）层析介质，两种分离纯化介质组合使用。纯化的方案可适应不同的细胞上清、抗体种类和用户的选择，同时仍将宿主细胞蛋白（HCP），病毒颗粒，核酸，产品相关杂质和培养基添加剂（例如甲氨蝶呤，胰岛素，维生素）清除到一定水平可用于最终的治疗用途。
两步层析过程具有高度的灵活性，因为层析介质可以双向流动，CEX和HCl介质都可用于捕获或精纯步骤，而无需进行过程内切向流过滤（超滤，TFF）。使用CEX色谱进行捕获可利用人类抗体的较高pI（通常高于8），从而可以在接近中性的pH值下捕获或结合它们（例如在pH值6.2条件下）。如果负载的pH值保持在中性附近或以上时，则HCl介质可适应各种电导率值。病毒灭活步骤可以在层析步骤之间或在第二次层析之后进行。进行病毒过滤的时候是在纯化过程结束之后，产品配制之前，这样对于除病毒过滤的体积更小，更易于管理，而且这个时候产品已完成了全部的纯化步骤。
现今，先进的各种层析填料所具有的独特性能使纯化工艺的简化（三步变为两步）成为可能。例如，疏水层析填料，一种基于HCI的层析介质，取决于结合的pH（中性及以上），但与电导率（最高1M的NaCl溶液）无关。这就是它使用极其灵活的原因。当使用疏水层析填料进行捕获时，介质对细胞培养上清液的高电导率不敏感，从而可以直接将细胞上清上样进行收获。还有，在收获抗体期间对细胞上清进行预调节可延长层析介质作为捕获步骤的使用寿命。
当进行抗体的洗脱时，疏水层析对上样过程中宽范的电导率耐受性特别有用。因此，由于疏水树层析介质可用于捕获或精纯，因此在建议的纯化方案中应该具有互换性。
在洗脱过程中可以看到疏水层析介质提供的另一个好处是，随着pH的降低，由于配体与抗体之间的静电排斥作用，产物得以回收，电导率在洗脱过程中没有重大影响。因此，当使用疏水层析介质进行捕获时，洗脱液可以使用低电导率收集，这样做的好处是第一步收集的制品不用进行任何的处理，就可以有效的结合到下一步的CEX层析柱上。因此，产品可以直接从HCI柱流到CEX柱，而无需任何过程中的超滤（TFF）。如果将疏水层析作为精纯步骤，洗脱缓冲液的电导率则具有更大的灵活性，因为HCl是最后的层析步骤。此外，疏水层析可被视为TFF的替代层析步骤。
疏水层析的优化
对HCI层析方法进行了多项研究，以最大程度地减少洗脱过程中的HCP含量。在捕获层析方法研究中，将洗脱过程中的电导率降低以及将洗脱pH从3-4提高到4.8-5.2有利于以最小的HCP相对量优先洗脱目标产物（下图）。
此外，我们通过降低洗脱流速实现了更高的纯度（下图）。
其他参数，例如低电导率洗脱和用磷酸盐缓冲液进行淋洗，也有助于从纯化的抗体中去除HCP。
最后，我们观察到疏水层析的结合能力不仅可以通过目标产物在色谱柱中的停留时间来控制，还可以通过在平衡和上样期间操纵缓冲液种类来控制。例如，当基于磷酸盐的缓冲液的强度从35mM降低到10mM时，特异性抗体的结合能力从13mg/mL增加到22mg/mL，增加了约70％。
下面我们看一个示例，来进一步了解疏水层析：
1 细胞上清收获和处理
收集含有单克隆抗体的细胞培养上清液，使用35或70mM磷酸钠缓冲液（pH 6.2）进行细胞上清的收集。对于将疏水层析用作捕获层析的实验，在上样之前将样品调节至中性pH值。
2 层析填料的选择
抗体将以15至45mg/mL的结合能力加载到CEX层析介质上。但是，如果使用载量更高的层析填料，有些层析填料的载量值可以进一步提高到超过100mg/mL。将产物在pH6.2下加入40至75mM NaCl缓冲液分步洗脱。疏水层析填料，平衡使用10、35或70 mM磷酸钠（pH 7.0至7.2），产品载量最大为22mg/mL。填料用10到45mM磷酸钠（pH 6.2到7.0）进行上样后淋洗，然后在用低电导率缓冲液洗脱。当使用pH范围为4.5-5.2的缓冲液时，使用另一种低电导率的缓冲液（例如10 mM乙酸钠或乙酸盐和磷酸盐双重缓冲液）进行洗脱。层析方法流程可以在下图中看到。
3 病毒灭活，除病毒过滤
低pH保持1小时。最终病毒过滤使用纳滤膜进行除病毒过滤。病毒清除率验证研究可在之后的研究中进一步研究。
4 宿主细胞蛋白质和残余DNA浓度的检测
中国仓鼠卵巢宿主细胞蛋白（CHO HCP）分析使用了ELISA试剂盒。使用qPCR定量分析残余DNA。
结果与讨论
纯化方法的A方法和B方法在最终的纯化中均产生了可比的质量。使用相似的材料和两个可互换的层析程序，我们获得了最终的目标产物，目标抗体在CHO HCP中的含量小于100ppm，10pg DNA/mg，单体百分含量＞95％（通过体积排阻HPLC测定）。
下表1A总结了A方案使用CEX色谱进行捕获时获得的结果。这种“方法”被四种不同的抗体采用。在第一根色谱柱后，宿主细胞蛋白质含量降低了50-200倍，浓度范围从约900-6000 ng/mg降低，在HCI层析柱后，其浓度降低至小于100ng/mg。CEX层析非常有效地清除了DNA（达7000倍），而HCl层析将残留的痕迹进一步减少至少于10pg DNA/mg抗体。
方案B产生了相当质量的结果（下表1B）。HCP被HCI降低了约90倍。与捕获的CEX层析相比，DNA的清除效率更高，使测量结果低于设定的最终检测量，这强调了疏水层析在清除核酸方面的高效率。
在两个方法上，HuMAb-1和HuMAb-2纯化方案最终纯度（单体％）和总回收率非常可比：分别超过99％和70％。
下表2总结了提出的其他两种单克隆抗体纯化方法的可扩展性。用DNA测量观察到最大的变异性。所有其余参数都非常可比。最终纯化的结果保持了实验室规模的质量。随着规模扩大，重复值往往会更好。
病毒清除
监管机构需要至少两个单独的步骤来在生产治疗性蛋时进行病毒灭活和清除。这些步骤必须基于不同的作用方式，通常是低pH病毒灭活和病毒过滤2个步骤。病毒灭活通常位于层析纯化步骤之间，但该步骤也可以位于两个纯化步骤之后。类似地，在第二个纯化步骤之后进行另外的特定步骤，例如病毒清除过滤。
下表3显示了使用方案A的HuMAb-6和HuMAb-7的病毒清除率。细胞培养上清液中病毒颗粒量有多达10log的感染性和非感染性病毒颗粒。对于该过程，A-MuLV清除的最小安全系数分别为HuMAb-6和HuMAb-7在7至10 log之间。因此，最终的抗体产品（抗体和残留的过程污染物）具有足够的病毒清除率和安全性病毒因子，可将其用作治疗制剂。
结论
随着抗体生产中表达量的提高，纯化过程必须提高过程效率和生产率。通过减少纯化过程步骤的数量，可以减少要制备的缓冲液的数量和过程成分。我们今天描述的两种纯化技术设计仅需对过程进行少量调整即可用于各种类型的蛋白质纯化。该方案是后续优化和更新步骤的起点，因为纯化参数通常可以优化，例如针对更高的结合能力范围。使用此方案的另一个优点是可以灵活选择特定产品或生产设施，使得纯化工艺是最方便的工艺步骤。
