1、PCR用引物的Tm值的计算方法?
引物为20mer以下时：
Tm=2℃×(A+T)+4℃×(G+C)
引物为20mer以上时：
Tm=81.5+0.41×(GC%)-600/L
当中L为引物的长度。
在PCR反应过程中选择Annealing温度时，一般为(Tm-5)℃。
2、设计PCR用引物时的注意事项?
能够 从以下几个方面考虑。
1.引物长度通常为20～25mer。但进行LAPCR时，引物长度应增长为30～35mer。
2.二条引物之间不能进行Annealing，对3′端的3个碱基需特别注意。
3.GC含量在50～60%，避开局部富含GC或AT，为了使引物和模板稳定结合，3′端应避开ATrich结构。
4.避开引物自身形成二级结构。
5.选择Tm温度相互接近的二条引物。
3、PCR用引物中含有Inosine(次黄苷)碱基，其Tm值怎样计算?
可以不考虑Inosine碱基，使用A、G、C、T计算Tm值就可以。
4、PCR用引物的使用量?
合适的终浓度可在0.1μM～1.0μM之间选择。引物的浓度太低时，有时扩增产物太少；引物浓度太高时，比较容易出现非特异性扩增反应。通常模板DNA的量较多或HighcomplexityDNA(例如HumangenomeDNA)作模板时，引物浓度应低一些；当模板DNA的量较少或LowcomplexityDNA(例如Plasmid等)作模板时，引物浓度应高一些。
5、简并性引物对PCR扩增有无影响?
有影响。简并数量应尽量少。
通常一条引物中简并的碱基不要超过4处，如果简并的碱基数过多，则会造成反应体系中有效引物的量相对减少，此时应适当增加引物的使用量。但引物量过大，容易引起非特异扩增，应加以注意。
6、50μlPCR反应体系中Template的加入量?
50μlPCR反应体系中模板DNA推荐使用量：
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人基因组DNA |
0.1μg~1μg |
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大肠杆菌基因组DNA |
10ng~100ng |
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λDNA |
0.5ng~5ng |
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质粒DNA |
0.1ng~10mg |
7、PCR产物(3‘端附有A碱基时)经末端平滑后，克隆于去磷酸的平滑末端载体时，其PCR产物需不需要5′末端磷酸化?
需要。一般的PCR用引物5′末端都不带磷(除非在引物合成时已特别标记)。使用这种引物进行PCR的PCR产物经末端平滑化后，与去磷酸的平滑末端载体连接之前，PCR产物必须进行5′末端磷酸化。
8、PCR产物需用限制酶进行消化时，需不需要进行Buffer交换?
在通常情况下，首先须把PCR产物进行纯化后再进行限制酶的酶切反应。但如果只使用PCR反应液的一部分(1～5μl)进行酶切反应时，能够 不经纯化使用限制酶进行20μl体系的酶切反应。
