PCR扩增获得双链DNA产物经变性形成单链,测序引物与其中一条模板链上的互补序列退火。退火的引物在低进行性反应条件下(如低温和低dNTP浓度),通过DNA聚合酶催化作用延伸20~80个核苷酸;由于此反应体系中掺入放射性标记的dNTP,能使新合成的DNA链中含有多个放射性标记,便于产生高放射显影度。标记的DNA链在高进行性反应条件下,通过DNA聚合酶催化进行延伸,通过在反应体系中掺入 ddNTP,使链延伸反应终止。反应产物经过电泳分离和放射自显影,就可以进行序列判读。

(1)DNA模板PCR产物离子交换色谱纯化,作为DNA模板,浓度为:0.01~0.1mmol/L。

(2)引物20个核苷酸的DNA引物可以不经过纯化,直接用作测序引物,引物浓度 l mmol/L 

(3)DNA聚合酶要求该酶在低温条件下仍具有活性,以便有效地在新合成的DNA链中掺入放射性标记。比如USB/ Amersham公司生产的测序酶2.0。

(4)测序反应缓冲液根据测序酶具体而定,如测序酶2.0的反应缓冲液可用40mmol/LTris-HCl(pH7. 5), 20mmol/L MgCI, Fl 50mmol/L NaCl.

(5)放射性标记的dNTP一般为[aP]dATP、[a3P]dATP或[a3S]dATP。

(1)制备链延伸终止反应混合物分别在4个微量离心管中各加入一种 dNTP/ddNTP的混合物2.5,其中dNTP和dNTP浓度分别为80m0/L和8pmol/L,37℃预热5mine 

(2)制备退火混合物在一个微量离心管中加入PCR扩增DNA1pmol,测序引物1012p5×测序反应缓冲液,用水调整至总反应体积10pl

在加热仪内94~96℃加热8min后,迅速放入冰浴中冷却lmin(适合于双链DNA模板),或者在加热仪内65℃加热6min后在加热仪内自然冷却到30℃(适合于单链DNA模板)。1000r/min离心10s后在冰浴中冷却,并迅速进行下一步操作。 

(3)标记反应在退火混合物中加入2l预冷的dNTP混合物(含dTTP、dGTP和dCTP各0.75mol/L,5C的[a2P]dATP),1plo.1mol/LDDT,现稀释的测序酶2U,并用水将反应体系调整到15.5,混匀后在冰上孵育2min,放射性标记新合成的DNA链。

(4)链延伸终止反应将3.5标记混合物分别加入4管链延伸终止反应混合物中,37℃进行链延伸终止反应5min。

(5)终止反应体系在各管中加入4终止液(95%甲酰胺,20mmo/ L EDTA,0.05%溴酚蓝,0.05%二甲苯腈蓝FF),终止反应。样品可以一70℃保存2~7d。电泳前在电热仪上80℃加热3min。 

(6)电泳分离和放射自显影每一泳道上样2~3μl,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。

P标记的需要过夜曝光显影,若用P标记的需要2~3d曝光显影,读片。

①标记反应最为关键,应在低进行性反应条件下进行。退火后引物只被延伸20~80个核苷酸,并在新合成的DNA链中掺入多个放射性标记。对高GC碱基含量的DNA模板,可用[aP]dCTP代替[aP]dATP。

②对高GC碱基含量的DNA模板,链延伸终止反应混合物中应用7-脱氧2dGTP替代dGTP,以消除电泳过程由于压缩现象产生的假带。