pcr循环测序法是利用热循环仪高效的自动循环能力,使链终止的序列产物以线性方式获得扩增,从而产生高显影度的序列梯度。首先将PCR扩增的DNA经变性形成单链形式,使标记引物(P、生物素或荧光标记)与其中的一条链上的互补序列退火。退火后的引物在耐热DNA聚合酶催化下发生链延伸终止反应。由此产生的模板链与延伸终止链形成的部分双链产物在下一轮测序循环中,再次被变性,释放出模板链,作为又一轮引发反应的模板,同时积累下每轮循环产生的链终止产物。这种循环步骤重复20~40次,使链终止产物以线性方式扩增。

与直接测序法相比较,循环测序法有如下优点:所需的模板DNA量少;在高温下进行,可使DNA聚合酶催化的聚合反应能够通过模板二级结构的区域;多轮的变性步骤便于对质粒DNA、ADNA、黏粒DNA和PCR产物等双链DNA模板进行测定,不需要经过一个单独的变性步骤而直接进行测序。

(1)模板可用PCR扩增好的DNA作模板,也可使用低浓度的dNTP(10~20mol/L)和引物(1mmol/L)来进行靶DNA的PCR扩增,然后直接用PCR产物作为模板。DNA模板浓度:0.01mmol/L

质粒DNA模板用质粒纯化试剂盒提取。对于高拷贝数的质粒可以直接从菌落中获得测序。测序反应的质粒典型用量:50~200mol

其它模板(M13、黏粒及ADNA)的制备为常规分子生物学手段。M3和ADNA作为模板用量:10~100mo黏粒DNA作为模板用量:50~200mol

(2)测序引物同位素标记测序引物:用[yP]ATP或[γP]ATP和T4多聚核苷酸激酶对引物的5末端进行同位素标记。引物浓度:0.1~0.2mmol/L

非同位素标记测序引物:用荧光标记4种双脱氧核苷酸,可以进行以荧光为基础的双脱氧测序反应。 

(3)DNA聚合酶应为无3→5外切活性的耐热DNA聚合酶。如 Taq dnA聚合酶。

(4)测序反应缓冲液根据所用的聚合酶具体而定。 

(5)放射性标记的dNTP根据所用的聚合酶具体而定 

(本操作方法是以同位素标记为基础的测序)

(1)标记引物取10~15pmol测序引物、50pCi的[ y-3P]ATP、5μ10×激酶缓冲液(商品厂家提供),加水至反应体系50,混匀后37℃预热5min

加人1μ现稀释的T4多聚核苷酸激酶(10U),37℃孵育30min;再加入10U的T4多聚核苷酸激酶,37℃继续孵育30min。

通过凝胶过滤柱除去未掺入的[yP]ATP

标记好的引物可在-70℃保存2周以上。 

(2)制备dNTP/ ddNTP混合物在4个微量离心管中各加入一种dNTP/ ddNTP混合物2ul

(3)制备反应混合物取相应的DNA模板、标记的测序引物1~2pmol、3pl的10×测序反应缓冲液、5U的 Taq dnA聚合酶,加水至总体积20l,混匀。在该混合物中加入某些试剂,如DMSO、 Triton X-100、吐温20或NP40等,彻底混合均匀,可以提高序列梯度的质量。

(4)循环反应分别取反应混合物4团l加人4管dNTP/dNTP混合物中,然后置于9℃的热循环仪上进行循环反应。每次循环包括:94℃变性1min、40~60℃退火30s和72℃链延伸终止30s。循环次数:20~40次。

(5)终止反应体系循环结束后,在各管中加入4pl终止液(95%甲酰胺,20mmol/LEDTA,0.05%溴酚蓝,0.05%二甲苯腈蓝FF),混匀。样品可在一70℃保存2~7d。电泳前在电热仪上80℃加热3min 

(6)电泳分离和序列判读每一泳道上样2~3pl,电泳。采用放射自显影方法进行序列判读标记的需要过夜曝光显影,若用P标记的需要2~3d曝光显影。

①在标记引物过程中,为获得高比活的标记引物,反应体系中引物、激酶及[YP]ATP要保持在一个最佳水平 

②确定最佳dNTP/dNTP比例非常关键,应采用产生低本底、高显影度的序列梯度所需要的最佳dNTP/dNTP比例。 

③为了提高靠近引物(1~100个碱基范围内)的序列梯度的自显影强度,可以向测序反应体系中加人Mn2,提高DNA聚合酶对掺入 ddTP的效率( Tabor等,1989)。而当为了提高远离引物(200~400个碱基范围内)的序列梯带的自显影强度,则需要提高链延伸终止反应混合液中dNTP的含量,具体依所用聚合酶而定。